發布日期：2020-07-23 19:23

腺病毒包裝的操作流程以及相關的技術問題

腺病毒包裝

重組腺病毒是一種復制缺陷型腺病毒載體系統，廣泛用于基因治療，基礎生命科學研究等領域。 重組腺病毒具有以下顯著優勢：感染范圍廣，幾乎所有細胞系，原代細胞和某些組織均可被感染； 感染效率高達100％，可以完全超過其他病毒載體工具和脂質體轉染。 大源基因攜帶能力（高達8Kb）； 非整合基因組 高滴度，操作方便。 因此，重組腺病毒是最有前途的基因傳遞工具之一。  

當前常用的腺病毒載體基于5型人腺病毒（Ad5），其基因組為36Kb長的線性雙鏈DNA。 腺病毒可以通過自身的纖維（纖維）與細胞表面的受體結合，被內吞到細胞中，然后利用細胞的轉錄和翻譯機制從內體（內體）轉移到細胞質和細胞核，從而開始復制和復制。而腺病毒包裝下，完整的病毒生命周期將導致細胞死亡并釋放病毒顆粒。  

目前，最常用的腺病毒包裝系統是AdEasy和AdMAX。 共同特征是首先將靶基因克隆到穿梭載體中，然后重組到大腺病毒主鏈中。 這兩個系統在腺病毒的早期轉錄復制基因E1和E3中都有缺陷，并且E3基因對于病毒生產不是必需的。 因此，腺病毒包裝必須依靠表達E1的細胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。

與Adeasy系統相比，AdMAX系統易于操作并且可以獲得更好的病毒滴度。 這些說明基于AdMAX系統，該系統由pHBAd系列穿梭質粒和腺病毒主鏈載體pBHGloxδE1、3Cre雙載體組成。  

 Baffir Biology的腺病毒是5型血清型腺病毒，它已經刪除了腺病毒早期表達基因序列的E1和E3區。  E1是腺病毒復制所必需的，缺少E1使其無法自行復制。 它只能依靠包裝細胞（例如HEK293細胞）提供的反式互補進行復制和擴增，以確保腺病毒的安全性。  E3基因表達的蛋白質可以對抗宿主的抗病毒防御系統，而E3區域的去除可以降低宿主體內的免疫系統。流行病應對。  

 Baffir的腺病毒包裝使用最新的AdMax系統，通過Cre-loxp重組酶，將腺病毒載體穿梭質粒和骨架質粒（腺病毒基因組）共轉染到HEK293細胞質粒中）在重組酶的作用下產生重組腺病毒， 所得病毒滴度較高，病毒滴度可達1×10 ^ 12pfu / ml。 布法羅生物系統的腺病毒載體有CMV，mCMV，CAG，PGK，UbC，EF1a和許多其他啟動子可供選擇； 并且有許多熒光標記蛋白，例如EGFP，ZsGreen，tdTomato，mCherry，EYFP等。  

原理是同源重組。 將目標基因表達盒插入腺病毒的左臂區域（通常缺少E1基因區域）以形成腺病毒穿梭質粒，然后用腺病毒基因組（通常缺失）將攜帶E1基因區域的細胞與大質粒一起轉染 例如，在293細胞中，這兩個質粒通過在293細胞中的同源重組形成重組腺病毒基因組，并包裝成病毒顆粒。 主要缺點是重組效率較低。  

與目前最流行的AdEasy系統相比，具有一定的優勢：AdMax系統僅需2-4周即可完成從質粒構建到病毒重組的整個過程，成功率大于98％  （其中95％的克隆包含靶基因），因為該病毒在真核細胞中重組，因此它維持了腺病毒生存的壓力，從而有助于重組腺病毒基因組的完整性。  AdEasy系統的成功率只有18-34％（Stratagene的新版本AdEasy XL系統的成功率約為94％），病毒基因組在原核細胞中重組（BJ5183）。 從理論上講，失去生存壓力的腺病毒基因組更容易發生突變，病毒的遺傳背景和活性可能會受到影響。  

腺病毒包裝的主要困難是如何在腺病毒主鏈載體上構建外源基因表達盒或外源shRNA表達盒。 由于腺病毒主鏈載體相對較大（> 30kb），并且在載體中幾乎有多個共同的限制性酶切位點，因此，如果通過常規限制性連接方法將外源基因或shRNA表達盒構建到腺病毒中， 成功率很低。 因此，目前的腺病毒表達系統基本上使用同源重組將外源基因或shRNA表達盒構建到腺病毒骨架載體上。  

 HonorGene的病毒打包平臺技術團隊在腺病毒打包方面擁有豐富的經驗。 自腺病毒包裝技術服務發展以來，已成功包裝了數百種各種類型的腺病毒，成功率高達99％； 包裝的最大靶基因超過4k； 腺病毒滴度不低于109pfu / ml，訂購1ml基本可以滿足您的實驗需求。